蛋白质印迹法的步骤是什么呢？

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蛋白质印迹法是一种蛋白质检测技术，最早是由美国人乔治.斯塔克发明的。它利用电泳技术把特定组织或细胞中的蛋白质分离出来，固定的NC膜或者PVDF膜上，再用特异性抗体检测特定的抗原。正是能找到引起疾病的抗原，这种技术现在已被广泛用于疾病诊断等多个生物领域。下面我们来看看它的猪蹄步骤。

一、原理

与Southern Blot或Northern Blot杂交方法类似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测。

二、分类

Western Blot显色的方法主要有以下几种：

i. 放射自显影

ii. 底物化学发光ECL

iii. 底物荧光ECF

iv. 底物DAB呈色

现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表。

三、样品制备

1.单层贴壁细胞总蛋白的提取：

2. 组织中总蛋白的提取：

3. 加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取。

蛋白质印迹法，一种找出基因表达错误引起的疾病的方法。这种快速能找的导致疾病的抗原，并且特异性抗体（一种蛋白质）被着色的优势，在研究遗传疾病，基因问题，疾病的检测上运用很多。在其制作的基础上，也在不断发展出新的检测技术，如Southern Blot杂交方法。

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